Smac模拟物LCL161抑制乳腺癌细胞体内外增殖及其机制的研究摘要
乳腺癌是一类具有较高异质性的肿瘤。在组织形态、免疫表型、临床表现、疾病进展、治疗反应和转归及预后等方面都存在着很大的差异,所以乳腺癌的治疗是在规范化的基础上更要求个体化。目前的治疗方案的选择,多建立在临床分期和分子分型的基础上,以手术为主的,化疗、放疗、内分泌和靶向等治疗的合理、有效、序贯进行的综合治疗。但是,最终有相当部分患者因为复发和转移而治疗失败,多数是因为对治疗方法产生耐受而导致的。细胞凋亡过程的调控异常也是肿瘤细胞耐药的原因之一,如何通过促进肿瘤细胞的凋亡抑制肿瘤的生长是目前抗肿瘤研究是一个热点方向,本课题试图根据肿瘤细胞凋亡失控的特性寻找新的靶点。在肿瘤的调控机制中,肿瘤凋亡抑制蛋白家族(IAPs)发挥着重要作用,第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激动剂(second mitochondria-derived activator of caspases,Smac)通过降解IAPs而对肿瘤发挥抑制作用。LCL161,是一种Smac小分子模拟物,通过绑定并参与下调多种IAPs,并通过激活caspase诱导细胞凋亡。研究表明,LCL161对多发性骨髓瘤、肝细胞肝癌、白血病等肿瘤细胞株有明显的抑制其增殖,促进细胞凋亡的作用,在联合化疗、放疗或靶向治疗中能发挥协同作用,可能提高治疗效果;动物实验研究表明,LCL161对部分实体瘤有一定的抑制作用;I期临床实验显示,口服LCL161,人体耐受性良好,吸收佳,毒性作用低。已有的研究均表明,LCL161是极有潜力的抗肿瘤活性成分,然而,其抗肿瘤的确切作用机制、临床疗效等方面尚缺乏明确报道。同时在关于LCL161在乳腺癌方面的研究上鲜有报道,具有极大的研究空间和价值。目的:观察LCL161对乳腺癌细胞株的增殖能力的影响,并探讨其诱导乳腺癌细胞株凋亡的可能机制,通过动物体内实验进一步证实其对乳腺癌的治疗效果,为LCL161成为乳腺癌新药的研究提供理论基础。方法:1.观察LCL161对乳腺癌细胞增殖能力的影响。1.1MTT法检测不同浓度和作用时间条件下,LCL161对乳腺癌细胞增殖能力的影响。1.2集落形成实验观测不同浓度的LCL161对乳腺癌细胞集落克隆形成能力的影响。2.LCL161诱导乳腺癌细胞细胞凋亡的作用及机制。2.1 PI染色检测不同浓度LCL161对乳腺癌细胞细胞凋亡率的变化。2.2 JC-1检测不同药物浓度下线粒体膜电位的变化。2.3免疫印迹法(western-blot)在蛋白水平上检测细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bak、Mcl-1)和凋亡抑制蛋白(cIAP1、cIAP2、XIAP)的蛋白表达情况。3.LCL161联合z-VAD-fmk诱导乳腺癌细胞程序性坏死的作用和机制。3.1 MTT法检测LCL161联合z-VAD-fmk对乳腺癌细胞增殖能力的影响,观察LCL161诱导的凋亡对Caspase的依赖性。3.2 MTT法检测LCL161联合Nec-1对乳腺癌细胞增殖能力的影响,观察单药LCL161是否诱发了程序性坏死。3.3 Annexin V-FITC/PI双染法检测LCL161和/或z-VAD-fmk和/或Nec-1干预乳腺癌细胞株后细胞凋亡比例的变化,推测LCL161联合z-VAD-fmk是否能诱发两种乳腺癌细胞程序性坏死的发生。3.4电子显微镜下观察LCL161和/或z-VAD-fmk和/或Nec-1干预后乳腺癌细胞株细胞亚微结构的变化,从细胞形态学上观察LCL161联合z-VAD-fmk是否能使乳腺癌细胞株发生了程序性坏死。3.5小干扰RNA(siRNA)受体相互作用蛋白1(RIP1)后,MTT法比较RIP1干扰前后细胞存活率的变化,探讨RIP1在LCL161联合z-VAD-fmk诱导乳腺癌细胞株程序性坏死信号途径中的作用。4.动物模型的建立和药物对乳腺癌裸鼠模型的影响。4.1动物模型的建立和药物实验,观察体内实验中LCL161对乳腺癌移植瘤的抑制效果。4.2免疫组化检测实验组和对照组肿瘤细胞c IAP1的蛋白表达情况结果:1.MTT法和克隆实验同时观察到:以LCL161不同给药浓度(1n M,10n M,100n M,1μM以及10μM)或不同作用时间点(24h、48h、72h)为变量,观测两种乳腺癌细胞株的细胞增殖生长情况。LCL161对MDA-MB-231和MCF-7两种细胞株的增殖和集落形成能力都有一定的影响:在同样的观察点上,存在浓度的相关性,随着给药浓度的增加,抑制的效果越明显。在同样的浓度上,存在作用时间的相关性,随着作用时间的增加,抑制的效果越明显。2.PI染色:通过流式细胞仪的检测,可以比较直观而且量化凋亡细胞和正常细胞的比例。应用LCL161干预后,MDA-MB-231和MCF-7细胞株在0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM时,计算出凋亡的细胞的比例分别是2.9%、8.8%、15.1%、21.5%、56.7%和2.4%、5.4%、13.3%、20.0%。表明随着药物浓度的增加凋亡的细胞的比例是呈逐步上升的趋势。3.检测浓度分别为0μM、0.5μM、1μM、2μM的LCL161处理后乳腺癌细胞株的线粒体膜电位的变化情况。在两种细胞株中,随着LCL161的浓度的递增,可以观察到红色荧光在逐渐减弱,而绿色荧光在逐渐增强,即JC-1单体在增多,多聚体的量逐步下降。推测出线粒体膜电位在逐步下降。4.应用western-blot法检测,随着LCL161的浓度逐渐增高,两细胞均表现如下:Bax基因蛋白表达呈递增趋势,而Mcl-1、Bcl-2基因蛋白的表达呈递减趋势。应用western-blot法检测细胞凋亡抑制蛋白cIAP1、cIAP2、XIAP的表达情况,从实验的结果可以观察出:1.随着药物作用时间的延长,cIAP1的蛋白的表达在两个细胞株中都存在逐渐减少的趋势。2.同样的方法和时间点,但是观察到cIAP2、XIAP的蛋白的表达变化不明显。 5.MTT法检测LCL161诱导的乳腺癌细胞凋亡对caspase的依赖性,观察应用泛caspase抑制剂z-VAD-fmk阻断由caspase介导的细胞凋亡以后,细胞的存活率变化。本阶段实验发现:单独应用z-VAD-fmk后,MDA-MB-231细胞和MCF-7的存活率分别为90.9%和94.0%,而LCL161联合z-VAD-fmk应用后出现细胞存活率(42.3%和69.3%)相对单用LCL161(70.0%和88.0%)明显下降(p=0.002和p=0.006),因而推测z-VAD-fmk联合LCL161后可能激活了其它类型的细胞死亡方式。6.MTT法观测LCL161和Nec-1单药和联合处理MDA-MB-231和MCF-7两种乳腺癌细胞株存活情况。联合应用后应出现细胞存活率(81.3%和84.6%)与单用LCL161(78.5%和82.8%)无统计学差异(p=0.062和p=0.253),说明单药应用Smac的模拟物LCL161不会诱导程序性坏死的发生。再一次证实LCL161联合z-VAD-fmk可能激活了程序性坏死的启动,从而诱发更剧烈的细胞死亡。7.Annexin V-FITC/PI双染法观测到:在针对MDA-MB-231细胞株7个实验组(空白对照、LCL161、z-VAD-fmk、Nec-1、LCL161+Z、LCL161+N和LCL161+Z+N)中,药物处理24小时后,观测到早期细胞凋亡的比例分别是0.9%、16.8%、0.8%、0.6%、72.4%、6.1%和7.7%,中晚期细胞凋亡的比例分别是1.8%、15.5%、1.7%、1.2%、20.8%、6.3%和2.7%。在同样处理的MCF-7的7个实验组中,观测到早期细胞凋亡的比例分别是0.0%、12.3%、11.0%、8.5%、34.1%、6.6%和5.8%,中晚期细胞凋亡的比例分别是0.0%、7.3%、6.5%、2.7%、59.6%、12.5%和3.1%。LCL161+Z相比较于单药LCL161能显著降低细胞的存活率,LCL161+Z+N相比较于LCL161+Z能提高乳腺癌细胞的存活率。说明LCL161+Z诱发了乳腺癌细胞的程序性坏死。8.在电镜下观察细胞中亚微结构的变化:在LCL161和LCL161+Nec-1组,细胞凋亡特征明显,细胞膜完整、胞浆可见凋亡小体,染色质固缩;在LCL161联和z-VAD-fmk组,凋亡和坏死特征共同存在,细胞膜结构几乎消失,可见空泡、出芽,胞浆凋亡小体可见,核仁基本完整,说明存在了程序性坏死。 9.RIP1干扰实验:单独加z-VAD-fmk组细胞存活率97.0%和99.0%;单独加LCL161组,细胞存活率下降,细胞存活率分别为80.0%和84.0%;联合LCL161+z-VAD-fmk组细胞存活率(61.0%和59.0%)和联合LCL161+z-VAD-fmk control siRNA组细胞存活率(53.0%和62.0%)相近,细胞存活率明显下降;联合LCL161+z-VAD-fmk RIP1 siRNA组,细胞存活率(77.0%和83.0%)上升。10.本实验可以观察到RIP1干扰后,LCL161联合z-VAD-fmk应用后引起的细胞的存活率较非干扰组显著升高(p=0.001和p=0.001)。11.在动物体内试验观测到LCL161对三阴乳腺癌瘤体的抑制效果(质量和体积)类似于阿霉素。12.免疫组化观察到,应用LCL161的动物的瘤体中c IAP1的蛋白表达都出现不同程度的降低。结论:1.LCL161能显著地抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能诱导IAP家族蛋白的降解有关。2.Caspase抑制剂可增强LCL161的抑制乳腺癌存活的作用,其产生疗效的可能机制是激活细胞程序性坏死通路引起的。RIP1在程序性坏死过程中起到重要的作用。3.乳腺癌裸鼠模型研究证明,LCL161具有体内抗肿瘤的作用,LCL161作为乳腺癌的新的治疗药物具有一定的临床研究前景。
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